Kolorektální karcinom (CRC) zaujímá mezi maligními onemocněními podle statistik celosvětově 3. místo v incidenci a 2. místo v počtu úmrtí. Většina nových případů vzniká bez prokazatelné genetické zátěže, hereditární syndromy jsou odpovědné za pouhých 5 % případů, familiární výskyt se týká zhruba 25 % případů a zbylých 70 % připadá na spontánně vzniklé CRC. Kromě klasických rizikových faktorů se pozornost zaměřuje také na roli a význam střevního mikrobiomu.
Pokud uvažujeme v absolutních číslech, bylo v roce 2020 zaznamenáno více než 1,9 milionu nových případů a téměř 520 tisíc úmrtí. Kumulativní riziko vzniku CRC u osob ve věku pod 75 let celosvětově dosahuje 2,25 %. V evropské populaci pak 3,6 %, přičemž muži mají toto riziko vyšší (4,5 vs. 2,85 % u žen). Lze také zaznamenat vzestup incidence časného CRC, tzn. diagnostikovaného u pacientů mladších 50 let.
Z histologického hlediska se jedná o nádory vycházející z epitelu sliznice tračníku a rekta. Podle histologické stavby samotného nádoru rozlišujeme (podle WHO): adenokarcinom, mucinózní adenokarcinom, karcinom z prstenčitých buněk, skvamózní karcinom, adenoskvamózní karcinom, nediferencovaný a neklasifikovatelný karcinom. Nejčastější variantou je adenokarcinom (cca 95 %) s různou diferenciací:
- G1 – dobře diferencovaný (sem řadíme tubulární nebo papilární karcinomy);
- G2 – středně diferencovaný;
- G3 – nízce diferencovaný (solidně uspořádané karcinomy) obecně s horší prognózou. Adenokarcinomy s nízkou diferenciací jsou časté v případě pravostranné lokalizace. Patology jsou dnes používány dva klasifikační systémy, a to TNM klasifikace a Dukesův systém (A – tumor ohraničen střevní stěnou, B – tumor zasahuje nebo proniká serózou, C1 – tumor + pozitivní perikolické lymfatické uzliny, C2 – tumor + pozitivní perivaskulární uzliny, D – vzdálené metastázy).
CRC metastazuje, jako většina karcinomů, primárně lymfogenní cestou do lokálních lymfatických uzlin. Později pak do vzdálených lymfatických uzlin a hematogenně nejčastěji do jater nebo plic, popřípadě najdeme metastázy v obou orgánech. Pokročilé onemocnění se může rozšířit do peritonea. Karcinomy rekta mají tendenci prorůstat do okolních orgánů. Výskyt vzdálených metastáz může být v některých případech odhalen i dříve než samotný primární nádor.
Molekulární problematika a diagnostika CRC
Molekulárně se sledují základní prediktivní a prognostické markery, kterými jsou bodové mutace v genech Kras a Nras a prognosticky sledujeme změnu genu BRAF pro cílenou terapii, mikrosatelitní instabilitu a další.
Rodina RAS
Molekulární diagnostika je zaměřena na detekci bodových mutací v genech signální kaskády RAS-RAF-MEK-ERK pomocí real time PCR a v současné době začíná být velkým přínosem testování pomocí NGS (sekvenování nové generace).
Nejdůležitějšími molekulami této kaskády jsou proteiny rodiny RAS (K-, N- a H-RAS) a BRAF. Aktivační mutace v těchto genech vede k autonomní stimulaci signální dráhy nezávislé na povrchovém receptoru, čímž dochází ke stimulaci buněk, přežívání a dediferenciaci spojené s metastazováním. Mutace v genu KRAS exonu 2, kodony 12 a 13 jsou identifikovány u cca 40 % pacientů, ostatní RAS mutace u cca 7 % pacientů a BRAF mutace u 8 % pacientů.
Dále se testují exony 3 a 4 (codon 59/61, 117/146) v genu KRAS a nově i NRAS exony 2, 3 a 4. (kodon 12/13, 59/61, 117/146). Stran rozdílného zastoupení KRAS mutací v primárním tumoru a v metastázách proti sobě stojí dva naprosto opačné výsledky.
Santini et al. dokázali vysokou konkordanci mezi primárním tumorem a metastázou s rozdílnými výsledky pouze u 5 % pacientů (N = 99), zatímco Fedyanin et al. došli k naprosto opačným závěrům s dyskordancí 26,3 % pro KRAS a 5,2 % pro NRAS. Primární tumor a metastáza tedy nadále zůstávají velkou výzvou v otázce molekulární onkologie včetně mechanizmu metastazování do jednotlivých orgánů.
Status molekulárního testování výše popsaných genových alterací je v případě pokročilého onemocnění nutné znát již před zahájením první linie terapie. U Ras, Braf wild type pak je volena anti EGFR léčba (cetuximab, panitumumab).
U mutovaných pacientů se využívá v první linii anti VEGF léčba (bevacizumab, v další linii aflibercept, regorafenib). Ta je preferovaná i v případě pravostranné lokalizace nádoru bez EGFR mutace.
Mutace BRAF
Dále se testují aktivační mutace genu BRAF, které se vyskytují u méně než 10 % sporadických CRC, nejčastěji se jedná o mutaci V600 (vedoucí v kodonu 600 k záměně valinu za jinou aminokyselinu) a je velmi negativním prognostickým faktorem jak v časných stadiích, tak u metastazujících CRC. Je třeba podotknout, že pacienti s BRAF mutací profitují z BRAF inhibitoru (enkorafenib).
Významně méně informací máme o efektu mutací mimo kodon 600. V rámci skupiny více než 9 600 pacientů s mCRC bylo pomocí sekvenování nové generace identifikováno 208 pacientů s mutací BRAF mimo kodon 600 (2,2 % všech pacientů a pětina pacientů s mutací BRAF). Což dokazuje, kam v budoucnu v testování zaměřit také pozornost.
Testování MSI
Testování mikrosatelitové stability začíná být běžnou laboratorní praxí a v budoucnu nezbytnou. Mutace v jednom z genů mismatch repair (MMR) se nachází v 15–20 % sporadických karcinomů střeva. V případě tumoru s deficitem MMR je typický výskyt velkého počtu replikačních chyb a mikrosatelitová instabilita je definována jako instabilita > 30 % mikrosatelitových oblastí.
U pacientů s lokalizovaným tumorem u vzdálených metastáz je MSI dobrým prognostickým faktorem a je spojena s delším přežitím. Navíc bylo prokázáno, že u pacientů s CRC stadia II s MSI nepřináší adjuvantní terapie s 5-fluorouracilem žádný benefit. Metody testování běžně využívané v klinické praxi jsou v tuto chvíli:
- imunohistochemie – chybění některého z proteinů je hodnoceno jako MSI;
- PCR technika – spočívá v amplifikaci definovaného panelu sekvencí obsahujících repetice, zkrácení nebo prodloužení těchto úseků > 30 % těchto sekvencí je hodnoceno jako MSI-H.
Nejen mutace, ale i epigenetické alterace typu metylace mohou vést ke snížení nebo úplné ztrátě exprese různých genů, např. genů pro proteiny účastnící se mismatch repairu. Hypermetylace promotorových sekvencí vede ke ztrátě exprese, typicky například MLH1. Zároveň je přítomnost hypermetylace vnímána jako špatný prognostický faktor a častěji se vyskytuje v pravé části colon.
Další možné testování
Oblastí zájmu molekulární diagnostiky je také predikce toxicity léčby pomocí farmakogenomických testů. Mezi sledované ukazatele patří dihydropyrimidin dehydrogenáza (DPD). Fluoropyrimidiny jsou základním chemoterapeutikem využívaným v léčbě CRC a celé řady dalších malignit.
Mechanizmus účinku spočívá v:
- narušení syntézy thymidin monofosfátu vazbou na thymidilát syntázu;
- zablokování replikace DNA zařazením fluorodeoxyuridin monofosfátu (FdUMP) do sekvence nukleotidů;
- zařazení FdUMP do sekvence RNA vedoucí k zastavení transkripce.
Rychlost katabolizmu 5-fluorouracilu je ovlivňována právě aktivitou enzymu dihydropyrimidin dehydrogenázy (DPD), který z účinné látky vytváří 5-fluoro-5,6-dihydrouracil, který katabolizuje přibližně 80 % podané dávky (zbytek je vyloučen močí). Snížení aktivity je přítomno u 5 % pacientů, její úplná ztráta u 0,5 % pacientů. Podání standardní dávky 5-fluorouracilu vede k rozvoji závažné toxicity stupně 3 a vyšší, nezřídka i k letální toxicitě. Přibližně dvě třetiny těchto změn aktivity lze vysvětlit jednou z patogenních mutací v genu DPYD. Nejčastější patogenní variantou je c. 1905 + 1G > A, méně často pak c. 2846A > T (p. D949V), c. 1679T > G (p. I560S), c. 1236G > A/HapB3 (c. 1129-5923C > G v intronu 10) a c. 1601G >A. Nosiči této mutace mají být léčeni na 50% redukovanou dávkou 5-fluorouracilu. Přestože se jedná o vyšetření relativně levné a dostupné, není v současné době rutině prováděno.
Lokalizace nádoru
Jak ukazuje text výše, terapie se odvíjí také od lokalizace nádoru. Některé studie ukazují, že karcinomy lokalizované v pravé části tlustého střeva mají nižší senzitivitu a odezvu na anti EGFR léčbu než karcinomy v jeho levé části. Důvodem bude jednak molekulární charakteristika s častější detekcí mikrosatelitové nestability (MSI) a mutacemi v genech rodiny RAS a BRAF, ale hlavním důvodem jsou změny v mezibuněčných spojích, zajišťující mezibuněčnou komunikaci. U nádorových buněk obecně je postrádána funkční mezibuněčná komunikace prostřednictvím gap junctions. Jejich proliferaci tedy neomezuje kontaktní inhibice.
U řady nádorových buněk k produkci proteinu dochází, ale může být posttranslačně modifikován, a neplnit tak správně svoji funkci. Tyto změny jsou častěji nalézány u pravostranně lokalizovaných karcinomů. Nexus gap junctions je typ spojení dvou sousedních buněk v místě, kde dochází k významnému přiblížení jejich membrán. Spojení je zprostředkováno pomocí membránových kanálků, tzv. konexonů, což jsou poloviční kanály tvořené šesti molekulami bílkoviny konexinu. Pomocí gap junctios jsou buňky dobře metabolicky i elektricky propojeny. V případě poškození jedné buňky dojde k rychlému uzavření kanálu. Tím se poškozená buňka odpojí od sousedních buněk, a zabrání tak jejich možnému poškození. Dnes víme, že u nádorových buněk je tento spoj funkčně postrádán či v minimu nebo se sníženou funkcí. Toto spojení je důležité pro průběh řady reakcí, např. v imunitním systému, při zánětu, hojení ran, ale i metastazování a karcinogenezi. Jak vyplývá z dostupných studií, pravostranná lokalizace je negativním prognostickým ukazatelem především pro karcinomy stadia III a IV s vyšším rizikem úmrtí. Terapeutické výsledky zahrnující i biologickou léčbu karcinomů s pravostrannou lokalizací jsou významně horší než u nádorů s levostrannou lokalizací.
Závěr
Pokroky v molekulární diagnostice jdou rychle dopředu, nové technologie urychlují testování a dávají nám nové informace, nicméně rozsah testování musí odpovídat možnostem léčby. Co je ovšem absolutní nutností, je stanovení multidisciplinárního týmu k rozhodování o ideální léčebné strategii.
MUDr. Libor Staněk
Chirurgická klinika, 3. LF UK v Praze
Ústav histologie, 3. LF UK v Praze